Florexxenza mikroskopija: prinċipji tal-metodu

Assorbiment u b'emissjonijiet mill-ġdid ta 'aktar fluwidi inorganiċi u organiċi dawl hija r-riżultat ta' phosphorescence jew fluworexxenza. Id-differenza bejn il-fenomeni huwa t-tul tal-intervall bejn assorbiment u l-emissjoni ta 'fluss tad-dawl. Meta l-fluworexxenza ta 'dawn il-proċessi jseħħu kważi simultanjament, filwaqt phosphorescence - b'xi dewmien.

informazzjoni storika

Fl-1852, British xjentist Stokes, l-ewwel deskritti fluworexxenza. Huwa introduċa terminu ġdid bħala riżultat ta 'l-esperimenti ma fluorspar, li jemettu dawl aħmar taħt dawl ultravjola. Stokes nnutat fenomenu interessanti. Huwa sab li l-wavelength tar-radjazzjoni fluworexxenti hija dejjem akbar mill-fluss tad-dawl eċitazzjoni.

Biex tikkonferma l-ipoteżi fis-seklu 19 kien hemm ħafna esperimenti. Huma wrew li varjetà ta 'kampjuni jiffluworixxu taħt l-influwenza ta' dawl ultravjola. Fost il-materjali, fost affarijiet oħra, kienu kristalli, reżini, minerali, klorofilla, drogi mhux raffinat, komposti inorganiċi, vitamini, żjut. -Użu dirett ta 'żebgħa għal testijiet bijoloġiċi bdiet biss fl-1930

Florexxenza mikroskopija: Deskrizzjoni

Uħud mill-materjali użati fl-ewwel nofs tal-istudji seklu 20 esibiti speċifiċità għolja. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Grazzi għall-prestazzjoni, li ma jista 'jintlaħaq permezz kontrastanti metodi, il-metodu ta' mikroskopija fluworexxenti sar għodda essenzjali fir-riċerka bijomedika u bijoloġika. Bl-istess mod riżultati importanti kienu miksuba, u għall-materjali.

? Liema vantaġġi l-metodu ta 'mikroskopija fluworexxenti? Użu ta 'materjali ġodda sar possibbli u l-għażla ta' komponenti submicroscopic ċelluli speċifiċi ħafna. mikroskopija fluworexxenti jistgħu jindividwaw molekoli singoli. Varjetà ta 'żebgħa jippermettu l-identifikazzjoni ta' oġġetti multipli fuq darba. Minkejja r-riżoluzzjoni spazjali limitata tal-limitu diffrazzjoni tat-tagħmir, li, imbagħad, jiddependi fuq il-proprjetajiet speċifiċi tal-kampjun, l-identifikazzjoni ta 'molekuli taħt dan il-livell huwa wkoll kompletament possibbli. Kampjuni varji wara awtoflorexxenza juru irradjazzjoni. Dan il-fenomenu huwa użat ħafna fil Petrology, botanija, l-industrija tas-semikondutturi.

karatteristiċi

Studju tessuti tal-annimali jew patoġeni spiss ikkumplikati jew dgħajfa wisq jew qawwija ħafna awtoflorexxenza mhux speċifiku. Madankollu, il-valur fi studji takkwista introduzzjoni fil-komponenti materjali eċċitati f'wavelength speċifiku u jarmu l-intensità fluss tad-dawl meħtieġa. Florokromi jaġixxu bħala żebgħa kapaċi indipendentement mehmuża għal strutturi (viżibbli jew inviżibbli). Għalhekk dawn ikollhom selettività għolja għall-mira, u l-quantum yield.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. mikroskopija fluworexxenti ġie użat ħafna peress li l-miġja ta 'kuluri naturali u sintetiċi. Li kellhom ċerti profili intensità ta 'emissjoni u eċċitazzjoni u mmirati għal miri bijoloġiċi speċifiċi.

Identifikazzjoni ta 'molekuli individwali

Spiss, f'kondizzjonijiet ideali, tista 'tirreġistra tiddix element separat. Għal dan, fost affarijiet oħra, huwa meħtieġ li tiġi pprovduta ħoss baxx biżżejjed tad-detector u l-isfond ottiku. molekula fluorescein għall-falliment minħabba l photobleaching jista 'jarmi sa 300 elf. Photons. Fil effiċjenza tal-ġbir ta '20% tal-proċess u jistgħu jirreġistrawhom f'ammont ta' madwar 60,000.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. mikroskopija fluworexxenti bbażata fuq photodiodes valanga jew multiplikazzjoni elettroniku, ippermetta-riċerkaturi li josservaw l-imġiba ta 'molekuli individwali permezz tat-tieni, u f'xi każijiet saħansitra minuti.

kumplessità

Kwistjoni ewlenija favur il-soppressjoni ta 'sfond istorbju ottiċi. Minħabba l-fatt li ħafna mill-materjali uzati fid-disinn ta 'filtri u lentijiet jippreżentaw xi awtoflorexxenza, l-isforzi ta' xjenzati fl-istadji bikrija kienu orjentati lejn il-produzzjoni ta 'komponenti li għandhom fluworexxenza baxx. Madankollu, esperimenti sussegwenti wasslu għal konklużjonijiet ġodda. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. B'mod partikolari, instab li mikroskopija fluworexxenti, ibbażata fuq riflessjoni interna totali, tippermetti li jinkiseb sfond baxxa u intensità għolja tad-dawl eċitazzjoni.

mekkaniżmu

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Il-prinċipji tal mikroskopija fluworexxenti, ibbażati fuq riflessjoni interna totali huwa l-użu ta 'mewġa evanescent jew evanescent. Dan iseħħ fil-konfini bejn il-midja ma differenti indiċi refrattiv. F'dan il-każ, ir-raġġ tad-dawl jgħaddi mill-priżma. Hija għandha parametru għoli indiċi refrattiv.

Il priżma li jmissu mal-soluzzjoni milwiema jew ħġieġ bl parametru baxx. Jekk raġġ ta 'dawl dirett lejn din f'angolu li hija aktar kritiku, ir-raġġ huwa rifless totalment mill-interface. Dan il-fenomenu, imbagħad, tikkawża mewġ nonpropagating. Fi kliem ieħor, il-kamp elettromanjetiku ġenerat li jippenetra fis-medju bil-parametru aktar baxx indiċi refrattiv sa distanza ta 'inqas minn 200 nanometers.

Il-mewġa evanescent intensità tad-dawl għandha tkun biżżejjed biex eċitati fluorophores. Madankollu, minħabba fond estremament żgħir tagħha, il-volum tiegħu se jkun żgħir ħafna. Ir-riżultat huwa sfond ta 'livell baxx.

modifika

mikroskopija fluworexxenti hija bbażata fuq riflessjoni interna totali, jistgħu jiġu implimentati bl epi-illuminazzjoni. Dan jeħtieġ lentijiet bi b'apertura numerika għolja (inqas 1.4, iżda huwa mixtieq illi laħqet 1.45-1.6), u parzjalment illuminati apparat qasam. L-aħħar jinkiseb b'daqs post żgħir. Għal aktar uniformità użu ċirku rqiqa, li tkun imblukkata minn porzjon tal-fluss. Għall-angolu kritika, wara li jkun hemm riflessjoni totali, għandna bżonn ta 'livell għoli ta' rifrazzjoni tal-mezz immersjoni fl-lenti u l-kopertura tal-ħġieġ tal-mikroskopju.