Metodu riċerka ġenetika molekulari

Biex tesplora u tidentifika varjanti fl-istruttura tad-DNA metodu ġenetika użat molekolari. Għal kull reġjun tad-DNA, li jesplora dan ir-reġjun tal-kromożomi, ġene jew allel, il-metodi huma differenti. Sottostanti kull metodu ġenetika molekulari jinkludi xi wħud jew manipulazzjoni oħra tal RNA u DNA. Dawn il-metodi huma kkaratterizzati minn kumplessità enormi, mingħajr kondizzjonijiet tal-laboratorju ma jistgħux jitwettqu, u l-persunal għandu jkun bi kwalifiki għolja. Dan ix-xogħol isir f'diversi stadji.

istadji

L-ewwel, RNA jew DNA kampjuni li għandu jiġi prodott. Hawnhekk, metodu ġenetika molekulari jistgħu jiġu applikati għal kważi kull materjal: tnaqqis ta 'demm, lewkoċiti, fibroblasti kultura, mukoża (mibruxa), anki l-follikuli tax-xagħar, - DNA tista' tinkiseb minn kwalunkwe kampjun. Huwa xieraq li juża kwalunkwe metodu ġenetiċi molekulari u l-għażliet varji tagħhom u jkunu DNA twil iżolati hija maħżuna iffriżat. It-tieni stadju huwa ddedikat għall-akkumulazzjoni tal-frammenti mixtieqa (amplifikazzjoni) tad-DNA, għaliex jgħin jiżgura l-polymerase chain reaction in vitro (in vitro mingħajr l-involviment ta 'organiżmu ħaj). Bħala riżultat, il-jimmulitiplika magħżula framment tad-DNA billi din ir-reazzjoni katina, u l-ammont ta 'żidiet DNA litteralment miljuni ta' drabi.

It-tielet pass fil-metodi ta 'riċerka ġenetika molekulari huwa preżunt restrizzjoni immultiplikat DNA (din il-frammentazzjoni, dmugħ jew qtugħ). Restrizzjoni mwettqa minn elettroforeżi fuq polyacrylamide jew ġel agarose. Dan il-metodu molekolari-ġenetika tal-istudju tal-framment tad-DNA tippermetti lil kulħadd biex jieħu pożizzjoni partikolari fil-ġell. Wara dan, il-ġell huwa ttrattat bl-ethidium bromide, kapaċi irbit mad-DNA, il-irradjazzjoni bid-dawl ultravjola, allura huwa possibbli li wieħed josserva porzjonijiet luminixxenza. Molekulari metodi dijanjostiċi ġenetiċi huma varjati u numerużi, iżda l-ewwel żewġ passi huma komuni għal kulħadd. Iżda sabiex jiġu identifikati frammenti tad-DNA, il-ġel jistgħu jiġu kkulurita, u ħafna metodi oħra eżistenti.

speċi

L-aktar metodi diretti u mifruxa sabiex ikunu osservati mycobacteria jistgħu jinkludu l-metodu molekolari ta 'hawn fuq tagħlim DNA ġenetika. Essenza tiegħu huwa li, sabiex jiġi identifikat il-materjal katina iskan ta 'frammenti speċifiċi ta' DNA ta 'patoġeni. Molekulari teknika dijanjostika ġenetika għad m'għandhomx b'mod aktar effiċjenti biex jirrikonoxxu dawn il-mard kif tuberkolożi. Uża l-polymerase chain reaction (PCR), tista 'tkun ċert li l-DNA oriġinali se jżidu l-għadd ta' kopji fi miljun darba, jiġifieri, se jkun hemm amplifikazzjoni, u se display-riżultati. Il-livell ta 'sensittività huwa għoli ħafna - aktar minn disgħin fil-mija, li huwa l-vantaġġ prinċipali ta' dan il-metodu.

Il-bqija tal-metodi molekulari-ġenetiċi ta 'riċerka dwar l-effettività ta' kopji multipli rendiment litteralment irdoppja, peress li f'dan il-każ il-kampjun abbozzar turi sekwenza oligonucleotide speċifiku jiżdied għal mija u sitt darbiet. Anki l-dijanjosi kultura ta 'tuberkulożi tas-sistema respiratorja jnaqqsu b'mod sinifikanti s-sensittività tagħha. Dan huwa għaliex il-mediċina moderna hija bbażata fuq metodi ġenetiċi molekulari ta 'dijanjosi ta' tuberkulosi. A metodu deskritt huwa effettiv b'mod partikolari meta nittrattaw ma 'patoġeni tal varjabbiltà antiġenika għolja, tiddetermina il-mod ieħor huwa ħafna iktar diffiċli - teħtieġ speċjali midja nutrijenti u koltivazzjoni żmien twil. metodi ġenetiċi bijokimiċi u molekulari jipproduċu effett differenti ħafna fuq ir-riżultati.

dijanjosi ta 'tuberkulosi

dijanjosi Marshall PCR tat-tuberkulożi aktar komunement juża dawk sekwenzi tad-DNA li huma speċifiċi għal kull erba 'tipi tal-marda. Biex jintlaħaq dan lgħan spiss jużaw primers li jiskopru sekwenza IS elementi (IS-986, IS-6110), kif dawn l-elementi jikkaratterizzaw ispeċijiet b'tendenza kbira li jpassu tuberkulożi Mycobacterium u dejjem preżenti kopji multipli fil-ġenoma. Ukoll estrazzjoni tad-DNA jistgħu jitwettqu minn kulturi puri u klinika (sputum ta 'pazjenti) b'xi metodu ieħor xieraq. Per eżempju, hemm metodu Boom fejn il-lysis buffer hija użata bbażata fuq il tijoċijanat guanidine u silika bħala 'DNA carrier. In-numru ta 'pazjenti li huma differenti batterjoloġiku foqra jiżdied kull sena, u għalhekk fil-prattika klinika stabbilixxiet livell kompletament differenti ta' organizzazzjoni: Metodu molekolari-ġenetika ta 'studju tad-DNA ġie rwol ewlieni fid-dijanjożi.

Madankollu, aħna nammetti li mhuwiex mingħajr żvantaġġi. Il-metodu PCR huwa l-użu ta 'spiss ġġib numru kbir ta' riżultati foloz-pożittivi, u r-raġuni hija mhux biss żbalji tekniċi, iżda wkoll il-karatteristiċi tal-metodu innifsu. Barra minn hekk, bl-użu dan il-metodu tad-dijanjosi li jiddetermina l-vijabbiltà ta 'mycobacteria, li ġew identifikati, huwa sempliċement impossibbli. Iżda dan l-iżvantaġġ mhuwiex l-aktar importanti. metodi ġenetiċi molekulari ta dijanjostiċi PCR tinvolvi r-riskju ta 'kontaminazzjoni ta' DNA mikobatteriċi. Rekwiżiti ta 'ċertifikazzjoni għal din ir-raġuni li għal-laboratorji PCR esklussivament maħsuba iebes, li jeħtieġu tliet postijiet separati. teknoloġija PCR huwa modern u kumplessi ħafna, jeħtieġ l-użu ta 'tagħmir xieraq u persunal għolja mħarrġa.

bacterioscopy

Meta r-riżultati dijanjosi tal-analiżi għandhom ikunu mqabbla ma 'data oħra: eżami kliniku, radjografija, mikroskopija smear, uċuħ u anki risposta għal trattament speċifiku huma importanti ħafna. F'dan il-serje, l-istudji PCR huwa biss wieħed mill-komponenti. Jikxfu l-patoġenu fil-dijanjosi bikrija jistgħu jkunu l-aktar sempliċi u aktar rapida metodi - batterjoloġiċi.

Hemm huwa użat mikroskopju dawl (kulur Ziehl-Neelsen) u fluworexxenti (Florokromi kulur). Il-vantaġġ huwa veloċità smear-riżultati. Iżda iżvantaġġ tiegħu hija ġustament ikkunsidrat il-kapaċità limitata minħabba sensittività baxxa. Madankollu, dan il-metodu huwa mogħti rakkomandazzjoni tal-WHO bħala l-aktar mod ekonomiku u l-art biex jikxfu pazjenti tuberkolożi. Sejbien ta 'b'metodu batterjoloġiku mycobacteria għandu valur tbassir u stmat eskrezzjoni kwantitattivament batterjali. Ħafna aktar kunfidenti biex jittrattaw miegħu metodi molekulari riċerka ġenetiċi ta 'tuberkulożi.

kulturi

lokalizzazzjoni aħjar ta 'mycobacteria jirrikonoxxu l-istudji kulturali. Żriegħ materjal patoloġiku li huwa magħmul fil-mezz tal-bajd: Mordovsky, Finn II, LJ, u simili. Punti ta 'riferiment ta' reżistenza tal-mycobacteria għall-mediċini u evidenza indiretta tal-effettività ta 'numru ta' mycobacteria u kolonji tagħhom in vitro, jekk il-metodu applikat tal-kultura riċerka. Biex tiżdied il-persentaġġ ta 'iżolament ta' inokulazzjoni mycobacteria ta 'materjal patoloġiku huwa miżmum fuq ambjenti multipli.

Jintlaħqu l-ħtiġijiet ta 'diversi kulturali, għotja u fluwidi patoġenu inklużi. Użati f'din is-sistema u t-tip kejl awtomatizzat VANTES tkabbir. Ħsad għandu jiġi kkunsidrat fl-inkubatur sa seba 'sa tmien ġimgħat. Sa din id-darba il-ħsad man-nuqqas ta 'tkabbir jista' jitqies negattiv. L-aktar mod effettiv biex tiskopri Mycobacterium tuberculosis tikkunsidra kampjuni bijoloġiċi: ħnieżer dijanjostiċi Indi jinfetta materjal, li huma estremament suxxettibbli għall-TB.

xi figuri

qasam interessanti ta 'studju, li nfetħet mill dijanjostika PCR kien li jistudja l-M. tuberkolożi - infezzjoni moħbija. Il-kunċett modern ta 'infezzjoni TB jissuġġerixxi li minn mitt nies li kienu f'kuntatt ma' M. tuberkolożi, disgħin jista 'jkun infettat, iżda biss għaxra minnhom huma l-mard attiva qed tkun żviluppata. Oħrajn għandhom immunità TB, u minħabba disgħin fil-mija tal-każijiet l-infezzjoni jibqa moħbija. Tinduna mudell għen metodu ġenetika molekulari.

Geneticists jgħidu li ħamsa u ħamsin fil-mija ta 'dawk li uċuħ patoloġika materjal kienu negattivi, u fil-mija ta' persuni infettati bl M. tuberkolożi tmenin, iżda flowing bl-ebda manifestazzjonijiet radjografiċi ta 'mard, PCR tweġibiet pożittivi riċevuti. Dan huwa metodu dijanjostiku ġenetika għenu biex jidentifikaw pazjenti f'riskju minn studji PCR, bir-riżultati tal-analiżi tagħhom (mikroskopija u kultura) kienu negattivi, u infezzjoni subklinika M. tuberkolożi kien preżenti.

riċerka moderna

Il-Federazzjoni Russa u laboratorji batterjoloġiċi tuża metodu aċċellerat ta 'konċentrazzjonijiet assoluti: attività reductase nitrat tal-mycobacteria ttestjati mill reaġent Griess. ċentri anti-TB użu ta 'metodu li jippermetti li tiġi ddeterminata r-reżistenza droga. Dan jinżera fil-midja likwidu, fejn awtomatizzati radjumetriċi u sistema fluworexxenti kontabilità tkabbir ta 'mycobacteria. Din l-analiżi ssir malajr - sa ġimagħtejn.

Bħalissa, qed jiġu żviluppati metodi ġodda: reżistenza għall-mediċini ta 'mycobacteria huwa mkejjel fil-livell ġenotip. Studju tal-mekkaniżmi molekulari ta 'ġeni ta' reżistenza u juri l-preżenza mycobacteria. Dawn il-ġeni huma assoċjati ma 'reżistenza għal ċerti mediċini. Per eżempju, ġeni Kasa, inhA, katG reżistenti għall isoniazid, ġene rpoB - rifampicin ġeni RNA 16Sp u rpsL - streptomycin, emb1 - li ethambutol, gyrA - fluorokwinolon u l-bqija.

mutazzjonijiet

Id-dijanjosi moderna żdied b'mod sinifikanti l-metodu livell molekulari ġenetika għall-istudju tad-DNA u jitħallew iwettqu studji fuq skala kbira ta 'mutazzjonijiet fil ispettru kollu tagħhom. Issa nafu li l-mutazzjonijiet aktar komuni fil-516, 526 u 531 kodoni l-ġeni rpoB, u identifika l-reżistenza għall-mediċini varji. Hemm firxa sħiħa ta 'metodi għall-klassifika ta' mycobacteria jużaw mhux biss metodi tradizzjonali - bijokimiċi, bijoloġiċi u kulturali, iżda wkoll użata ħafna tekniki ġenetiċi moderni molekulari. Diġà hemm huma adegwati u jipprovdu l-metodu dijanjosi korretta għall-iskoperta ta 'mard monogenic. Dawn huma bbażati fuq studji tad-DNA fil-qasam eżatta ta 'ġene partikolari. Dan normalment huwa proċess kumpless, ħin u jiswew ħafna flus, iżda l-informazzjoni li hija pprovduta permezz ta 'analiżi ġenetika molekulari, huwa ħafna aktar preċiża u informattiv minn din id- data ta' kull analiżi oħra.

Kien ilu magħruf li d-DNA ma jbiddilx għall-ħajja kollha tal-organiżmu li huwa fi kwalunkwe ċelluli odnakova nukleati, u dan jagħmilha possibbli li jittieħdu l-analiżi ta assolutament ċelloli kollha tal-ġisem, fi kwalunkwe stadju tal ontogeny. Il-ġene ħsara tista 'tiġi skoperta qabel l-apparenza tal-ewwel sintomi tal-mard kliniku fuq skala sħiħa, kif ukoll fin-nies eterozigoti b'saħħithom, iżda li jkollhom mutazzjoni fil-ġene. Molekulari metodi dijanjostiċi ta 'mard ereditarji ġenetika jippermettu li jiġu rivelati (approċċ dirett, tad-DNA dijanjożi) tagħha, kif ukoll biex tanalizza l-segregazzjoni tal-marda fil-familja mad-DNA loci markatur (polimorfiżmi ġenetiċi), li huma marbuta mill-qrib ma' ġene ħsara (jiġifieri, l-approċċ indirett ta 'DNA-dijanjożi). Direttament jew indirettament - kull dijanjosi tad-DNA hija bbażata fuq il-metodi ta 'identifikazzjoni f'porzjon definit b'mod strett mill-DNA tal-bniedem.

metodi diretti

metodi diretti ta 'dijanjosi DNA huma meta l-marda ereditarja ġene ħati huwa magħruf, kif magħrufa sew, u t-tipi ta' mutazzjonijiet tagħha. Per eżempju, metodi diretti adatti numru ta 'mard. Dan kolera Huntington (estensjoni CTG-ripetizzjonijiet), fenilketonurja (R408W), fibrożi ċistika (delF508, mutazzjonijiet maġġuri) u simili. Il-vantaġġ ewlieni tal-metodu dirett huwa eżattezza dijanjostiku kompletament proprjetà, u m'hemmx bżonn li tagħmel analiżi tad-DNA tal-bqija tal-familja. Jekk mutazzjoni fil-ġene korrispondenti tinstab, din tippermetti preċiżament japprova dijanjosi ta eredità, determinazzjoni ġenotip għall-bqija tal-familja mgħobbija.

Vantaġġ ieħor ta 'dijanjosi diretta hija kkunsidrata li jidentifika trasportatur eterożigota ta' mutazzjonijiet ħżiena mill-qraba u l-ġenituri li mietu mill-marda. Dan huwa speċjalment veru għal mard awtosomali reċessiv. Żvantaġġi ta 'metodi diretti huma wkoll disponibbli. Biex tapplika għalihom, għandek bżonn tkun taf eżattament jillokalizzaw l-ġene anormali, l-istruttura Exon-intron tal-ispettru u mutazzjonijiet tagħha. Mhux kollha mard monogenic llum rċevew tali informazzjoni. metodi diretti Informativeness ma tistax titqies kompluta, għaliex wieħed u l-istess ġene jista 'jkollu numru kbir ta' mutazzjoni patoloġika li jikkawża l-iżvilupp ta 'mard ereditarju.

metodi indiretti

metodi indiretti fid-dijanjostika tad-DNA huma wżati fil-livelli kollha, f'każijiet oħra, jekk il-ġene ħsara ma tkunx identifikata, iżda biss chromosomally, jew jekk id-dijanjożi linja ma tatx ir-riżultat (dan jiġri, jekk l-ġene organizzazzjoni molekulari kumplessi jew fil-biċċa l-kbira, jekk ikun hemm ħafna mutazzjonijiet patoloġiċi). metodi indiretti mwettqa analiżi segregazzjoni ta 'markaturi polimorfika fil-familja allelic. Markaturi misjuba fl-istess reġjun kromosomali jew standi hija strettament marbuta mal-marda u jirrappreżentaw tħassir jew inserzjonijiet, punt sostituzzjonijiet, jirrepeti, u polimorfiżmu tagħhom hija dovuta għal ammont differenti ta 'ċelloli fil-blokka.

Aktar konvenjenti għad-dijanjosi meqjusa microsatellite u minisatellite polimorfiżmi indiretti, li huma distribwiti b'mod wiesa 'fil-ġenoma tal-bniedem. valur tagħhom espressa kontenut ta 'informazzjoni għolja, jekk ħsara għad-distanza ġenetika bejn il-markatur u l-ġene ma jkunx kbir wisq. Fl-aħħar każ, il-preċiżjoni istima hija determinata sa ċertu punt il-frekwenza tal rikombinazzjoni bejn l-markatur polimorfika u l-ħsara. metodi dijanjostiċi indiretti jipprovdu wkoll pass preliminari obbligatorja ta 'frekwenzi alleli tal-istudju popolazzjoni analizza fost il-pazjenti u t-trasportaturi ta' mutazzjonijiet, flimkien mal-ħtieġa ta 'determinazzjoni tal-probabbiltà ta' rikombinazzjoni tad nonequilibrium u adeżjoni markaturi u alleli mutanti.

metodi oħra

segmenti qosra ta 'RNA jew DNA, kif ukoll ġene wieħed viżwalizzati li qed jiġi studjat mikroskopiċi ma tistax tkun, għalhekk, li jiġu identifikati mutazzjonijiet meħtieġa mill dijanjosi ġenetika molekulari. Hemm "Proġett Ġenoma tal-Bniedem", kif ukoll l-avvanzi oħra fil-ġenetika molekulari ħafna estiża l-possibbiltà ta 'l-dijanjosi ta' mard ereditarju - kemm qabel u wara t-twelid. Dawn il-metodi jistgħu jipprovdu rilevament bikri u tagħmel poly- previżjoni u mard monogenic, li debutt iseħħ fil-ħajja adulta. Sfortunatament, minħabba l-kapaċitajiet tekniċi ta 'studji ġenetiċi molekulari huma kultant lil hinn mil-limiti etiċi li huma stabbiliti fir-rigward tal-wirt, speċjalment meta l-dijanjosi hija fl-adoloxxenza u t-tfulija.

anormalitajiet strutturali u numeriċi fil-kromożomi huma l-iktar kawżi komuni ta 'mard u l-kanċer, u ħafna malformazzjonijiet. aberrazzjonijiet kromosomali jeħtieġ li jiġu identifikati, li huwa importanti għall-pariri tal-familja - biex jivvaluta l-previżjoni, flimkien ma 'riskju riproduttiva fil tqala futuri. analiżi kromożomi huwa l- "istandard tad-deheb" ta 'dijanjosi ġenetika, iżda huwa limitat. Biss il-metodi ta ' analiżi ġenetika molekulari jistgħu jagħmlu aktar, minħabba jintuża hemmhekk klonazzjoni teknoloġija bbażata tikketti fluworexxenti kapaċi sensittività għolja tagħhom biex jidentifikaw bidliet fil-kromożomi sottili li huma impossibbli li jinstabu klassiku studji ċitoġenetiku. Dawn it-tekniki huma dejjem aktar jespandu l-kapaċitajiet dijanjostiċi tagħna, meta eżaminat, tfal b'diżabilitajiet żvilupp, ritardazzjoni mentali, ma 'ħafna mard ereditarju oħra.

sejbiet

Huwa importanti ħafna għall-umanità kienu l-istruttura tal-ġeni u l-funzjoni ta 'għarfien, it-tipi ta' varjabilità, l-kapaċità li jikxfu mard ereditarju li seħħew b'konnessjoni mal-iżvilupp tal-ġenetika molekulari. metodi tagħha huma mmirati lejn l-istudju tal-molekula tad-DNA - u meta huwa normali, u jekk ikollu xi danni. Preparazzjoni ta 'sekwenzi ta' aċidu deoxyribonucleic ta nukleotidi (DNA) jestendi fi stadji milli jirċievi kampjuni biex jidentifikaw frammenti individwali. Iżolament ta 'DNA ġenomiku mill-ċelloli, restrizzjoni (dmugħ), amplifikazzjoni (klonazzjoni), elettroforeżi tal-frammenti (jisseparaw ċarġ elettriku tagħhom u l-piż molekulari bl ġel agarose). Identifikazzjoni ta 'frammenti speċifiċi li jinsabu fuq il-wiċċ ta' strixxa diskreti.

Imbagħad jkollna fil-filtri speċjali att, li permezz tiegħu jgħaddi kull ibridizzazzjoni framment ma frammenti tad-DNA kklownjati jew sondi radjuattivi sintetiċi huwa kontroll, li se jkun ugwali għal kull kampjun tat-test. Jekk inti jibdel il-pożizzjoni jew tul meta mqabbla ma 'l-sonda, jekk framment ġdid jew sparixxew - dan kollu jissuġġerixxi li l-ġene analizzata għadda ristrutturar fil-sekwenza nukleotida. Hemm tmien tekniki bażiċi ta 'studji ġenetiċi molekulari: sekwenzar (determinazzjoni ta' sekwenza ta 'DNA), reazzjoni katina polimerażi (żieda fin-numru ta' sekwenzi), it-tħejjija ta 'primers magħrufa ġeni, klonazzjoni-DNA, produzzjoni ta' molekuli recombinant derivati proteini minħabba molekuli recombinant, ħolqien ta 'sett komplut (ġbir librerija) kklonati frammenti li kienu miksuba bl-użu restrizzjoni.